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酶免反應(yīng)顯色淡、靈敏度偏低的原因及解決方案
一、主要原因分析
標(biāo)本問(wèn)題?
目標(biāo)蛋白濃度過(guò)低?：標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)濃度低于檢測(cè)下限，導(dǎo)致抗原-抗體結(jié)合不足?。
干擾物質(zhì)存在?：如高濃度脂質(zhì)、血紅蛋白、類(lèi)風(fēng)濕因子或防腐劑(如疊氮鈉)抑制反應(yīng)?。
試劑與操作問(wèn)題?
抗體效價(jià)不足?：一抗/二抗保存不當(dāng)(反復(fù)凍融、過(guò)期)或稀釋比例不匹配?。
孵育條件不當(dāng)?：溫度或時(shí)間未達(dá)標(biāo)(如37℃孵育不足30分鐘)?。
洗滌不凈：殘留未結(jié)合抗體或干擾物，或洗液配制錯(cuò)誤(如濃縮洗液未按比例稀釋)?。
儀器與參數(shù)問(wèn)題?
酶標(biāo)儀濾光片設(shè)置錯(cuò)誤?：波長(zhǎng)選擇不當(dāng)(如TMB底物應(yīng)選450nm)?。
顯色時(shí)間不足?：TMB底物孵育時(shí)間過(guò)短(建議15分鐘以上)?。
二、針對(duì)性解決方案
優(yōu)化標(biāo)本處理?
低濃度標(biāo)本可通過(guò)超濾離心濃縮?。
添加蛋白酶抑制劑或稀釋樣本以減少基質(zhì)干擾?。
驗(yàn)證試劑與操作?
檢查抗體效價(jià)，重新滴定工作濃度(如抗體套裝，效價(jià)≥1:5000)?。
嚴(yán)格控溫控時(shí)(37℃振蕩孵育)，避免酶標(biāo)板干燥?。
規(guī)范儀器使用?
校準(zhǔn)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)(如TMB底物450nm)?。
延長(zhǎng)顯色時(shí)間(TMB孵育15分鐘)并避光操作?。
三、擴(kuò)展閱讀
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